את הקריירה רבת השנים החל בנאי, נצר למשפחת בנאי המפוארת, במהלך שירותו הצבאי, כשלמד בסטודיו למשחק של פאני לוביץ'. אחר כך התקבל ללימודים בבית הספר למשחק של הבימה והצטרף לשורות התיאטרון הלאומי. בין המחזות המפורסמים בהם שיחק אפשר למצוא את 'תל אביב הקטנה', 'רביזור', 'נמר חברבורות', 'מלאכת החיים' ו'קִין'.
בשנת 1963 הקימו המחזאי ניסים אלוני, בנאי ואבנר חזקיהו את 'תיאטרון העונות', שפעל במשך שלוש שנים, ובו העלו את הצגתו של אלוני 'הנסיכה האמריקאית' ואת עיבודיו ליצירותיהם של צ'כוב, גוגול, פדו ורבים אחרים.
בשנת 1961 הקליט ביחד עם יונה עטרי, אבנר חזקיהו וסשה ארגוב את תוכנית השירים 'יוסי חזקיונה', ומרגע וזה ואילך הוציא לאור את כשרונו המוזיקלי, והעלה תוכניות בידור שאת חלקן כתב בעצמו, כמו 'ילדות קשה' ו'נישואין נוסח גירושין', אותן העלה יחד עם רבקה מיכאלי, 'אני וסימון ומואיז הקטן', 'שובו של הסוראמלו' ו'מיומנו של ישראלי שפוי'.
יוסי בנאי אף כתב וביים חמש תוכניות בידור ללהקת הגשש החיוור, בה חבר אחיו, גברי בנאי. בין התוכניות שהפכו לקלאסיקה: 'קסיוס קליי נגד חלפון', 'אופסייד סטורי', ו'עובדים עלינו עבודה עברית'. מלבד הגשש, כיכב במערכונים איקונים, בהם 'רבע עוף או בורקס' ו'זהירות נהגת' עם רבקה מיכאלי, שמטיבי הלכת מבינינו עדיין זוכרים מילה במילה.
מלבד כשרונו המוזיקלי והקומי הבלתי נלאה, קולו של בנאי היה ידוע גם כן בפני רבים, ובייחוד אהבתו הרבה לשירים צרפתיים נוסטלגיים; הזמר המוכשר והמרגש הרבה לשיר שירים צרפתיים מתורגמים של ז'ורז' ברסנס, ז'אק ברל ואחרים, ואף הקדיש לכך כמה אלבומים וחלק מערבי היחיד שלו, כמו התוכניות משירי ברסנס 'אין אהבות שמחות' משנת 1969.
בנאי היה מוערך כל כך בקרב זמרים, אומנים ואף פוליטיקאים רבים, ובפרס ישראל לתיאטרון בו זכה בשנת 1998, נאמר עליו: "יוסי בנאי מבטא בכישרונותיו, באישיותו, בעולמו היצירתי את השילוב המיוחד של שחקן, במאי, כותב ואיש הבימה".
בשנת 2019 יצא לאקרנים הסרט הדוקומנטרי 'להאיר את יוסי', ממואר קולנועי שעשוי מאינספור קטעי ראיונות, הופעות ועוד של יוסי בנאי, המלווים אך ורק בקולו הענוג. הסרט הוקרן בהקרנת בכורה בפסטיבל הקולנוע בירושלים, ומשם יצא להקרנות מסחריות ברחבי הארץ.
לציון 18 שנה, יואב חנני, העורך המוזיקלי של רדיו 103fm, שזר את מיטב שיריו בשני חלקים. כך, לצד תחושת המחסור והגעגוע הרב ליוסי ולנוכחותו הבימתית המרשימה, אנו מקווים כי הצלילים יצליחו לגרום לכם גם להפליג בזיכרונות אל ימים פשוטים וזכים יותר. האזנה נעימה.
התרעות פיקוד העורף